Normele din 14 iunie 2002

Anexa -------

la norme

--------

DETERMINAREA

conținutului de acid erucic în uleiuri și grăsimi destinate

ca atare consumului uman, precum și în componenta uleioasa

sau grasa a produselor alimentare cu adaos de uleiuri sau grăsimi

I. INTRODUCERE

1. Prepararea probei pentru analiza

1.1. Generalitati

Masa probei de laborator destinate analizei de laborator trebuie să fie în mod normal de 50 g, exceptându-se cazul în care este necesară o cantitate mai mare.

1.2. Pregătirea probei pentru analiza de laborator

Proba trebuie omogenizata înainte de analiza.

1.3. Conservare

Proba preparata trebuie menținută în permanenta într-un recipient ermetic.

2. Reactivi

2.1. Apa

2.1.1. Când se menționează apa pentru soluții, diluari sau spalari, se face referire la apa distilata sau demineralizata de puritate cel puțin echivalenta.

2.1.2. Când se menționează o soluție sau o diluare, fără alta indicație asupra reactivului, se face referire la o soluție apoasa.

2.2. Reactivi chimici

Toți reactivii chimici trebuie să fie de calitate analitica recunoscută, cu excepția unor specificații contrare.

3. Aparatura

3.1. Lista cuprinzând aparatura

Lista cuprinzând aparatura conține numai piese destinate utilizării specializate și care prezintă specificații speciale.

3.2. Balanța analitica

Prin balanța analitica se înțelege o balanța care are o precizie de cel puțin 0,1 mg.

4. Prezentarea rezultatelor

4.1. Rezultate

Rezultatul scris pe buletinul de analiza oficială reprezintă valoarea medie obținută din cel puțin două determinări a căror repetabilitate este satisfăcătoare.

4.2. Calculul procentului

Cu excepția unor prevederi speciale, rezultatele sunt exprimate în procente de masa din acizii grasi totali din proba primită de laborator.

4.3. Număr de cifre semnificative Rezultatul comporta un număr de cifre semnificative în funcție de precizia metodei.

II. DETERMINAREA ACIDULUI ERUCIC

1. Obiectivul și domeniul de aplicare

Metoda permite determinarea conținutului de acid erucic din următoarele:

a) uleiurile și grasimile care conțin acid cetoleic (un izomer cis- al acidului docosenoic care se găsește în uleiurile de peste); și

b) uleiurile și grasimile hidrogenate care conțin izomeri trans- și cis- ai acidului docosenoic.

2. Principiu

Esterii metilici ai acizilor grasi componenți ai uleiului și grasimii sunt separati prin cromatografie în strat subtire prin argintare la temperatura scăzută și se determina cantitativ prin cromatografie gaz-lichid.

3. Reactivi

3.1. Eter dietilic uscat, fără peroxid, proaspăt distilat

3.2. n-Hexan

3.3. Silicagel G pentru cromatografie în strat subtire

3.4. Silicagel pentru cromatografie în coloana

3.5. Soluție de nitrat de argint, 200 g/l. Se dizolva 24 g nitrat de argint în apa și se completează cu apa până la 120 ml.

3.6. Soluție de erucat de metil, 5 mg/ml. Se dizolva 50 mg erucat de metil în cativa mililitri de n-Hexan și se diluează cu n-Hexan până la 10 ml.

3.7. Soluție etalon interna de tetracosanoat de metil, 0,25 mg/ml. Se dizolva 25 mg tetracosanoat de metil în cativa mililitri de n-Hexan (vezi pct. 3.6) și se dilueaza cu n-Hexan până la 100 ml.

3.8. Solvent de developare. Toluen și n-Hexan în raport de 90:10 (v/v).

3.9. Soluție de 2,7 diclorofluoresceina, 0,5 g/l. Se dizolva prin încălzire și se agita 50 mg de 2,7 diclorofluoresceina în 100 ml soluție apoasa conținând 50% metanol.

4. Aparatura

4.1. Aparat pentru cromatografie în strat subtire, care cuprinde următoarele:

4.1.1. o unitate de congelare, capabilă sa mențină recipientul de developare și conținutul sau la o temperatura de la minus 20°C la minus 25°C;

4.1.2. plăci din sticlă, 200 x 200 mm;

4.1.3. lampa cu raze ultraviolete;

4.1.4. coloane din sticlă, cu lungimea de aproximativ 200 mm, diametrul intern de aproximativ 10 mm. prevăzute cu filtre din vata de sticlă ori sticlă sinterizata, sau palnii mici prevăzute cu filtre din sticlă sinterizata;

4.1.5. un aplicator pentru depozitarea soluțiilor, în forma de banda ingusta sau dunga pe plăci de TLC

4.2. cromatograf gaz lichid cuplat cu un integrator electronic

5. Mod de operare

5.1. Pregătirea esterilor metilici ai acizilor grasi

Se ia o proba de aproximativ 400 mg componenta de ulei sau grasime a probei pentru analiza și se prepara o soluție care conține aproximativ 20-50 mg/ml esteri metilici ai acizilor grasi din n-Hexan.

5.2. Cromatografie în strat subtire

5.2.1. Pregătirea placilor

Se introduc 60 g silicagel (pct. 3.3) într-un balon cu fund rotund de 500 ml, se adauga 120 ml soluție de nitrat de argint (pct. 3.5) și se agita un minut până la obținerea unei paste foarte omogene. Se întinde pasta în mod obișnuit pe plăci; grosimea stratului trebuie să fie de aproximativ 0,5 mm. Aceasta cantitate de pasta este suficienta pentru prepararea a cinci plăci de 200 x 200 mm.

Se usucă parțial plăcile cu aer, de preferinta în intuneric, aproximativ 30 de minute. Se usucă și se activează plăcile prin uscare în cuptor, mentinandu-l la 100°C timp de 2 ore și 30 de minute. Plăcile trebuie utilizate cat mai repede posibil după faza de activare sau se păstrează cu atenție într-un spațiu intunecat și se reactiveaza înainte de utilizare. (Notă: Activarea la 110°C timp de o ora poate fi satisfăcătoare cu condiția ca plăcile sa nu se innegreasca.) Se traseaza liniile prin invelisul de 10 mm, de la marginile și vârful fiecărei plăci, înainte de reducerea marginilor pe parcursul developarii.

5.2.2. Aplicarea esterilor metilici

Cu ajutorul aplicatorului (pct. 4.1.5) se depozitează 50 æl soluție de esteri metilici (pct. 5.1) preparata din proba de analiza pe o linie subtire cu lungimea de aproximativ 50 mm, la cel puțin 40 mm de marginile placii și 10 mm de baza. Se aplica în mod similar 100 æl soluție care conține volume egale de soluție preparata de esteri metilici (pct. 5.1) și soluție de erucat de metil (pct. 3.6). Aplicarea soluțiilor necesita o atenție deosebită datorită fragilitatii substratului. [Notă: Dacă se dorește, se pot aplica 50 æl soluție de erucat metilic (pct. 3.6) pe placa pentru a ajuta la identificarea benzii de erucat metilic după developare (vezi figura).] După aplicarea esterilor metilici se introduce baza placii în eter dietilic până ce eterul urca la aproximativ 5 mm deasupra zonei de aplicare a probei de analiza. Aceasta operație concentreaza esterii metilici pe o bandă ingusta.

5.2.3. Developarea placilor

Se toarna soluția de developare (pct. 3.8) în cuva la o adancime de aproximativ 5 mm și se introduce cuva prevăzută cu capac într-un congelator (pct. 4.1.1) la minus 25°C sau la o temperatura cat mai apropiată de aceasta. (În unele cazuri este avantajoasă protejarea pereților cuvei cu o captuseala.) După doua ore se introduce placa cu atenție în cuva și se lasă soluția până ce atinge aproximativ o jumătate și două treimi din înălțimea placii. Se scoate placa și se evapora cu atenție soluția din aceasta într-un curent de azot. Se reintroduce placa în cuva și se lasă soluția sa ajungă până la vârful placii. Se scoate placa și după ce se usucă într-un curent de azot se pulverizeaza cu atenție cu soluție de 2,7 diclorofluoresceina (pct. 3.9).

Se examinează placa în raze ultraviolete și se localizeaza banda care conține erucatul metilic din proba în raport cu banda mai intensa din proba la care s-a adăugat erucatul metilic (vezi figura).

5.2.4. Separarea fracțiunilor de ester metilic

Se razuieste banda de erucat metilic ce provine din proba, într-un pahar de laborator de 50 ml, prevenind pierderile. În mod similar se transfera silicagelul situat peste și sub banda de erucat metilic în alt pahar de laborator de 50 ml. Aceasta banda va conține toate celelalte fracțiuni de esteri metilici ai acizilor grasi. În fiecare pahar de laborator se adauga 1,0 ml soluție etalon de tetracosanoat de metil (pct. 3.7) și 10 ml eter dietilic (pct. 3.1). Se agita și se transfera separat conținutul din paharele de laborator în coloane sau în palnii (pct. 4.1.4) conținând fiecare aproximativ 1 g silicagel (pct. 3.4); se extrag de trei sau patru ori esterii metilici cu 10 ml eter dietilic. Se colectează filtratele în baloane mici. Se evapora fiecare filtrat în cantitate mica utilizându-se un curent slab de azot și se transfera esterii metilici în eprubete mici de sticlă cu fund plat. Se evapora restul soluției cu un curent de azot, astfel încât să se concentreze esterii metilici pe fundul eprubetelor. Se dizolva esterii metilici în aproximativ 25-50 æl de n-Hexan (pct. 3.2).

5.3. Cromatografie gaz-lichid

5.3.1. Se analizează 1-2 æl de soluții de esteri metilici obținute din (i) fractia conținând erucatul de metil și (îi) fractiile conținând alți esteri metilici ai acizilor grasi.

5.3.2. Prin integratorul electronic se obțin următoarele zone de vârf:

1. din cromatograma fractiei care conține erucatul metilic:

a) erucat de metil [E];

b) etalon intern [L(1)];

c) zonele totale de vârf ale esterilor metilici care exclud etalonul intern [EF];

2. din cromatograma fractiilor care conțin alți esteri metilici ai acizilor grasi:

a) zonele de vârf de esteri metilici totali care exclud etalonul intern [RF];

b) etalonul intern [L(2)].

6. Prezentarea rezultatelor

6.1. Formula și modul de calcul

6.1.1. Conținutul de acid erucic din proba, exprimat ca ester etilic în procente din esterii metilici ai acizilor grasi totali preparati din proba, este dat de următoarea formula:

E

------------------------ X 100,

/

EF

RF

L(1) (

---- + ----

)

L(1)

L(2) /

în care E, EF, RF, L(1) și L(2) sunt zonele de vârf definite la pct. 5.3.2, corectate, dacă este necesar, cu ajutorul factorilor de etalonare.

În scopuri practice conținutul de erucat de metil obținut prin formula de mai sus este echivalent cu nivelul de acid erucic exprimat în procente din nivelul total de acizi grasi din proba.

6.1.2. Dacă zonele de vârf sunt exprimate în procente, valorile pentru EF și RF pot fi calculate după cum urmează:

EF = 100 - L(1)

RF = 100 - L(2)

6.1.3. Metoda de calcul (pct. 6.1.1) presupune ca nivelul de acid tetracosanoic din proba este neglijabil. Dacă anumite cantități din acest acid sunt prezente, valoarea acidului tetracosanoic (L(2)) obținut prin cromatograma fractiilor care conțin alți esteri metilici ai acizilor grasi se poate reduce astfel:

L(2) - T(2),

unde

T(0)P(2)

T(2) = ---------

P(0)

și

T(2) = zona de vârf a tetracosanoatului metilic provenind din proba care constituie o parte din zona de vârf atribuită etalonului intern al cromatogramei fractiei rămase a esterilor metilici ai acizilor grasi;

P(2) = zona de vârf a palmitatului metilic obținută prin cromatograma fractiei rămase;

T(0) = zona de vârf a tetracosanoatului obținută prin cromatograma esterilor metilici ai acizilor grasi totali conform determinarilor prin analiza;

P(0) = zona de vârf a palmitatului metilic obținută prin cromatograma esterilor metilici ai acizilor grasi totali conform determinarilor prin analiza.

6.1.4. Originea formulei

Proporția de acizi grasi din fractia care conține erucatul de metil, exprimată în procente de acizi grasi totali din proba, este data de următoarele formule:

EF

-----

L(1)

E

-------------- X 100

sau

----------------------- X 100

/ EF

RF

/

EF

RF

( ---- + ---- )

L(1) (

---- + ----

)

L(1)

L(2)/

L(1)

L(2) /

Proporția de acid erucic din fractia conținând erucatul de metil este data de formula:

E

-------

EF

Astfel, conținutul de acid erucic al probei, exprimat în procente din acizii grasi totali, este dat de următoarele formule:

EF

E

E

------------------- X --- X 100 sau

-------------------- X 100

/ EF

RF

EF

/ EF

RF

L(1) ( ---- + ---- )

L(1) ( ---- + ---- )

L(1)

L(2)/

L(1)

L(2)/

6.1.5. Repetabilitate

Diferența dintre rezultatele celor două determinări ale aceleiași probe, efectuate simultan sau în succesiune rapida, în aceleași condiții, de către același analist, nu trebuie să depășească 10% din rezultat sau 0,5 g pentru 100 g proba, luând valoarea cea mai mare.

Cromatograma tip în strat subtire prezentând separarea esterilor

metilici din acidul erucic, acidul cetoleic, izomerii

trans- ai acidului docosenoic

- Figura -

-

NOTA C.T.C.E. PIATRA NEAMT

Figura se afla la pag. 8 din Monitorul Oficial al României, Partea I, Nr. 532/22.07.2002.

-----------