Normele din 21 martie 2006

Anexa -----

la norma sanitară veterinara

----------------------------

PLANURI

de prelevare a probelor și metode de diagnostic pentru

depistarea și confirmarea AIS și criterii pentru zonare

și supraveghere oficială ce urmează suspiciunii sau confirmării AIS

Introducere și definiții

Prezenta anexa:

a) furnizează liniile directoare și cerințele minime pentru planurile de prelevare a probelor și metodele de diagnostic pentru depistarea și confirmarea prezentei AIS;

b) integreaza prevederile și definițiile stabilite de Norma sanitară veterinara privind condițiile de sănătate a animalelor, care reglementează punerea pe piața a animalelor și a produselor de acvacultura, aprobată prin

Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 494/2001 , publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 191 din 21 martie 2002, ce transpune

Directiva Consiliului 91/67/CEE

, și de Norma sanitară veterinara cu privire la măsurile minime pentru controlul anumitor boli ale pestilor, aprobată prin

Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 241/2002 , publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 813 din 8 noiembrie 2002, ce transpune

Directiva Consiliului 93/53/CEE

;

c) stabilește prevederile având ca scop punerea unui diagnostic corect, controlul și supravegherea AIS, în caz de suspiciune sau confirmare a AIS;

d) se adresează atât autorităților responsabile pentru controlul AIS, cat și personalului laboratorului ce efectuează testări cu privire la aceasta boala. Se bazează pe procedurile de prelevare a probelor, principiile și aplicatiile testelor de laborator și evaluarea rezultatelor acestora, precum și pe tehnicile detaliate de laborator. Cu toate acestea, atunci când este adecvat, laboratoarele pot aplica modificări ale testelor descrise în prezenta anexa sau pot utiliza teste diferite, cu condiția să se demonstreze ca au o sensibilitate și specificitate echivalente sau superioare. În plus, sunt stabilite criteriile pentru stabilirea zonarii și supravegherii oficiale ca urmare a suspicionarii sau confirmării AIS.

Pentru scopul prezentei anexe, se vor aplica următoarele definiții suplimentare:

a) zona de captare a apei - întreaga zona de captare, începând de la sursa cursului de apa până la estuar, sau o parte a acestei zone, începând de la sursa de apa până la o bariera naturala ori artificiala care previne migrarea peștelui de la aceasta bariera;

b) zona de coasta - o parte a coastei sau a apei marii ori a unui estuar, cu o delimitare geografică precisa, ce consta într-un sistem hidrologic omogen sau într-o serie de asemenea sisteme.

I. Criteriile pentru diagnosticarea AIS și pentru stabilirea zonelor, anumite măsuri de control și supraveghere oficială

I.1. Principii generale pentru diagnosticul AIS

Motivele rezonabile pentru ca pestii să fie suspectati ca fiind infectati cu virusul AIS sunt enumerate la pct. 1.2. Statele membre ale Uniunii Europene trebuie să se asigure ca în urma unei suspiciuni la o ferma cu pești infectati cu virusul AIS se va efectua cat mai curând posibil o ancheta oficială pentru a confirma sau a infirma prezenta bolii prin inspecție și examinare clinica, precum și prin recoltarea și selectarea probelor și a metodelor de examinare la laborator, asa cum sunt stabilite la pct. III și IV. În scopul confirmării oficiale a prezentei AIS trebuie să fie îndeplinit oricare dintre cele trei seturi de criterii stabilite la pct. I.3:

I.2. Suspiciunea infectiei cu AIS

I.2.1. Prezenta AIS trebuie suspectata dacă se îndeplinește cel puțin unul dintre următoarele criterii:

a) prezenta unor constatări post-mortem compatibile cu prezenta AIS, cu sau fără semne clinice de boala. Constatările post-mortem și semnele clinice de boala trebuie să fie în conformitate cu cele stabilite de editia curenta a Manualului Organizației Internaționale a Epizootiilor (O.I.E.) de diagnostic pentru bolile animalelor acvatice;

b) izolarea și identificarea virusului AIS în culturi celulare de la o singura proba prelevata de la orice peste din ferma descrisă la pct. III;

c) o proba rezonabila a prezentei AIS în cel puțin două teste independente de laborator, cum ar fi: PCR-RT (pct. IV) și testul IAF (pct. V);

d) transferul pestilor vii într-o exploatatie unde exista motive serioase de a suspecta prezenta AIS în momentul transferului pestilor;

e) acolo unde o investigatie prezintă alte elemente epidemiologice substanțiale care să conducă la AIS - ferme suspecte sau confirmate.

I.2.2. Suspiciunea de AIS poate fi exclusa dacă investigațiile, implicând cel puțin o inspecție clinica pe luna pe o perioadă de 6 luni, nu mai evidențiază semnificativ prezenta AIS.

I.3. Confirmarea AIS

Prezenta AIS trebuie considerată ca și confirmată dacă este îndeplinit unul dintre criteriile de la lit. a), b) sau c):

a) semne clinice și constatări post-mortem compatibile cu AIS, în conformitate cu editia curenta a Manualului O.I.E. de diagnostic pentru bolile animalelor acvatice, incluzând: moartea, slabirea sau comportamentul anormal al peștelui, semne de anemie sau dacă sunt observate alte constatări post-mortem și schimbări patologice, iar virusul AIS este detectat după una dintre următoarele metode sau mai multe:

(i) izolarea și identificarea virusului AIS în cultura celulara de la cel puțin o proba prelevata de la orice peste din ferma descrisă la pct. III;

(îi) detectarea virusului AIS prin metodele PCR-RT descrise la pct. IV;

(iii) detectarea virusului AIS în tesuturi sau în preparate tisulare prin intermediul anticorpilor specifici împotriva virusului AIS (de exemplu: testul indirect cu anticorpi fluorescenti sau amprentele renale descrise la pct. V);

b) izolarea și identificarea virusului AIS în doua probe de la unul sau mai mulți pești, din ferma testata în diferite ocazii, folosindu-se metodele descrise la pct. III;

c) izolarea și identificarea virusului AIS din cel puțin o proba prelevata de la orice peste din ferma, folosindu-se metodele descrise la pct. III, cu confirmarea existenței virusului AIS în preparate tisulare provenite de la orice peste din ferma, folosindu-se fie PCR-RT (pct. IV), fie testul IAF (pct. V).

I.4. Criterii pentru stabilirea și revocarea zonelor pentru control și supraveghere oficială ca urmare a suspiciunii și confirmării AIS

I.4.1. În scopul stabilirii unui program de supraveghere oficială bazat pe risc, statele membre ale Uniunii Europene trebuie să stabilească controale corespunzătoare și zone de supraveghere în vecinătatea unei exploatații a carei infectare cu AIS este suspectata sau confirmată oficial.

I.4.2. Zonele pentru control și supraveghere oficială stabilite trebuie să fie definite pe baza unei analize de la caz la caz a riscului răspândirii ulterioare a bolii. În conformitate cu situația epizootica, zona de captare a apei sau zona de coasta:

(i) trebuie să fie definită ca zona de control; sau

(îi) se poate ca zonele de coasta și zonele de captare a apei extinse să fie divizate în zona de control și zona de supraveghere, dacă împiedicarea răspândirii AIS nu este compromisa.

În plus, supravegherea adițională a zonelor poate să fie, după cum este necesar, stabilită în afară zonei de captare a apei sau a zonei de coasta.

I.4.3. Factorii principali de luat în considerare pentru stabilirea zonelor de mai sus sunt cei care influențează riscurile de răspândire a bolii la pestii din ferme sau la cei salbatici, precum: numărul, rata și distribuția mortalitatii pestilor din ferma suspectata sau în care s-a confirmat infectarea cu virusul AIS; cauza mortalitatii din ferma respectiva; distanta până la fermele din vecinătate și densitatea acestora; fermele de contact; speciile prezente în ferma; managementul care se aplică în fermele afectate și în cele invecinate; condițiile hidrodinamice și alți factori semnificativi epidemiologic, identificati în cadrul investigatiilor epizootice efectuate în conformitate cu art. 5 alin. (2) și art. 8 din Norma sanitară veterinara aprobată prin

Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 241/2002 .

I.4.4 Pentru stabilirea zonelor pentru control și supraveghere oficială se vor aplica următoarele criterii minime:

I.4.4.1. Autoritatea Naționala Sanitară Veterinara și pentru Siguranța Alimentelor trebuie să stabilească o zona de control în vecinătatea imediata a fermelor în care s-a confirmat prezenta virusului AIS, după cum urmează:

- în zonele de coasta: zona inclusă într-un cerc cu raza egala cu cel puțin lungimea unei deplasări a mareei sau cu o lungime de cel puțin 5 km, cu centrul în ferma în care s-a confirmat existenta virusului AIS, sau o zona echivalenta determinata în conformitate cu datele hidrodinamice și epidemiologice corespunzătoare; sau

- în zonele interioare: întreaga zona de captare a apei din ferma în care s-a confirmat infectarea cu virusul AIS; în zonele extinse de captare a apei Autoritatea Naționala Sanitară Veterinara și pentru Siguranța Alimentelor poate să limiteze extinderea zonei la părți ale zonei de captare, cu condiția de a nu compromite împiedicarea răspândirii AIS.

I.4.4.2. O zona temporară de control trebuie stabilită, în cazul suspicionarii prezentei virusului AIS, pe baza acelorași criterii care au fost trasate pentru zona de control.

I.4.4.3. O zona de supraveghere trebuie stabilită, dacă este necesar, de către Autoritatea Naționala Sanitară Veterinara și pentru Siguranța Alimentelor în afară zonei de control în sectoare în care este considerată suficienta o supraveghere mai puțin intensa și trebuie să corespundă cu:

- în zonele de coasta: o suprafața care în jurul zonei de control se suprapune zonei ce acoperă distanta deplasarii mareei sau o suprafața care inconjoara zona de control și este cuprinsă într-un cerc cu raza de 10 km pornind din centrul zonei de control ori o zona echivalenta, determinata în conformitate cu datele hidrodinamice și epidemiologice; sau

- în zonele interioare: dacă este necesar, cu o zona extinsă, situata în afară zonei de control stabilite.

I.5. Vid sanitar și suprimarea zonelor stabilite

I.5.1. Autoritatea competența din România se va asigura ca toate fermele din cadrul zonelor de control fac obiectul unei perioade corespunzătoare de vid sanitar după ce au fost golite de peste și dezinfectate după cum este necesar.

Durata perioadei de vid sanitar în ferma în care s-a confirmat infectarea cu AIS trebuie să fie de cel puțin 6 luni. Durata perioadei de vid sanitar pentru alte ferme aflate în zone de control va fi determinata de autoritatea competentă, evaluandu-se riscul fiecărui caz.

Atunci când toate fermele din zona de control sunt golite, se vor aplica cel puțin 6 săptămâni de vid sanitar sincronizat.

În plus, autoritatea competentă poate decide asupra instituirii vidului sanitar în fermele din zonele de supraveghere stabilite.

I.5.2. Zonele de control stabilite nu pot fi suprimate și repopulate până când toate fermele situate în aceste zone nu au fost golite de peste, dezinfectate după cum este necesar și supuse vidului sanitar în conformitate cu pct. I.5.1. Când este efectuată repopularea zonelor, zonele de control trebuie transformate în zone de supraveghere, asa cum este stabilit la pct. I.4.4.3.

I.5.3. Zonele temporare de control stabilite nu pot fi suprimate până când nu a fost exclusa suspiciunea de AIS în conformitate cu pct. I.2.2. În cazul confirmării AIS în conformitate cu pct. I.3, zona temporară de control va fi transformata în zona de control.

I.5.4. Zonele de supraveghere stabilite nu pot fi suprimate decât după 2 ani de la suprimarea zonei de control.

I.6. Supravegherea oficială ca urmare a suspiciunii sau confirmării AIS

I.6.1. Cu referire la art. 5 alin. (2) și la art. 6 din Norma sanitară veterinara, aprobată prin

Ordinul ministrului agriculturii, alimentației și pădurilor nr. 241/2002 , ce transpune

Directiva 93/53/CEE

, și pentru a stabili distribuția și evoluția bolii ca urmare a suspiciunii sau confirmării AIS într-o ferma, un program oficial de supraveghere bazat pe risc trebuie efectuat de autoritatea competentă ori de serviciile calificate de sănătate a pestilor în toate fermele situate în zona stabilită, cu consultarea și sub controlul autorității competente.

I.6.2. Pentru scopul aplicării unui astfel de program de supraveghere oficială, autoritatea competentă trebuie, dacă este necesar, printr-o inspecție la fața locului, sa identifice toate fermele din zonele stabilite și să facă un recensământ oficial al tuturor speciilor, categoriilor și numărului pestilor care sunt ținuți în ferme, incluzând și cifrele de mortalitate.

I.6.3. În urma recensamantului oficial inițial, fermele din cadrul zonelor de control temporare stabilite, care conțin somonul de Atlantic (Salmo salar) sau orice alta specie la care cea mai recenta editie a Codului O.I.E. de sănătate a animalelor acvatice se referă ca fiind susceptibilă sau potențial purtătoare de AIS, trebuie să raporteze autorității competente, la fiecare 14 zile, date asupra mortalitatii. Mortalitatea crescută trebuie raportată zilnic și pe cusca. Autoritatea competența trebuie să investigheze orice creștere semnificativă a mortalitatii într-o ferma.

Dacă suspiciunea este confirmată, toate fermele din zonele de control stabilite trebuie să raporteze săptămânal autorității competente asupra mortalitatii, în fiecare zi și pe fiecare cusca.

Fermele care se afla în zonele de supraveghere vor raporta rata mortalitatii autorității competente la fiecare 14 zile.

În plus, inspecțiile se vor efectua regulat timp de un an în zonele prestabilite și cu frecventa precizate în tabelul nr. 1. Cu toate acestea, când condițiile climatice fac ca aceste inspecții sa nu fie posibile o perioadă din an, Autoritatea Naționala Sanitară Veterinara și pentru Siguranța Alimentelor poate stabili în planul de contingenta alta frecventa pentru inspecții.

Programul de supraveghere oficială

- Tabelul nr. 1 -

Localizarea fermei

Numărul minim de inspecții într-un an

Numărul minim de inspecții într-un an după ce zona a fost suprimată

Zonă de control

12

Zonă de supraveghere

6

6

Zonă temporară de control

6

Programul de supraveghere va fi continuat până când zona va fi suprimată.

I.6.4. Inspecțiile, precum și selecția, colectarea, prepararea și expedierea probelor trebuie efectuate potrivit pct. II.1, II.2, II.3 și II.4. Examinarea probelor trebuie facuta în conformitate cu pct. III și IV.

II. Inspecția și prelevarea probelor

II.1. Inspecția, selecția și colectarea probelor la o ferma unde se suspecteaza prezenta AIS

II.1.1. La inspecțiile obișnuite efectuate în cadrul programului de supraveghere oficială descris la pct. I.6 și în fermele suspecte de infectarea cu anemia infectioasa a somonului, toate echipamentele fermelor (custi, rezervoare sau lacuri artificiale) vor fi inspectate pentru a se detecta prezenta eventualelor cazuri de pești morți, slabiti sau care au un comportament anormal. Pe cat posibil, pestii morți de curând (nedescompusi), slabiti sau cu comportament anormal vor fi examinati pentru a detecta semnele clinice sau pentru a efectua constatarea post-mortem a prezentei anemiei infectioase a somonului, asa cum este descrisă în actuala editie a Manualului O.I.E. pentru diagnosticul bolilor animalelor acvatice.

II.1.2. Dacă sunt observate semne clinice recente, compatibile cu cele ale anemiei infectioase a somonului, sau un inspector ori un medic veterinar are un alt motiv sa suspecteze faptul ca peștele ar putea fi infectat, se va colecta un număr de cel puțin 10 pești pentru examenul de laborator. Pe cat posibil, probele se vor preleva din rândul cazurilor recente de mortalitate și al celor slabite sau cu un comportament anormal. Dacă nu sunt suficienti pești care să prezinte semne clinice, atunci numărul de probe va fi completat cu pești sanatosi, selectați din custi, rezervoare sau lacuri artificiale care prezintă cel mai mare nivel de mortalitate sau de pești care arata semne clinice de boala.

II.1.3. Dacă se observa cazuri recente de mortalitate, slabire sau de comportament anormal, însă semnele clinice, împreună cu constatările post-mortem, nu sunt compatibile cu semnele anemiei infectioase a somonului, recoltarea probelor nu este obligatorie, deși aceste recoltari pot fi cerute de inspectorul sau medicul veterinar pentru efectuarea diagnosticului diferențiat.

II.1.4. Acolo unde pestii proveniți din ape naturale sunt suspectati ca fiind infectati cu anemia infectioasa a somonului, Autoritatea Naționala Sanitară Veterinara și pentru Siguranța Alimentelor se va asigura ca probele corespunzătoare sunt prelevate și examinate prin metodele clinice și de laborator adecvate, după cum este stabilit la pct. II-VI, pentru a exclude sau a confirma prezenta anemiei infectioase a somonului și pentru a aprecia dacă apariția bolii prezintă o amenințare semnificativă pentru ferma piscicolă.

II.2. Pregătirea probelor provenite de la pești

II.2.1. Probele pentru examinarea histologica trebuie prelevate doar de la pești care au fost ucisi de curând, care aveau semnele clinice sau constatările post-mortem compatibile cu prezenta bolii. Se vor preleva probe din orice leziune interna sau externa și, în orice caz, probe de ficat, de rinichi median, inima și splina vor fi prelevate de la fiecare peste, folosindu-se un bisturiu, și vor fi transferate într-o soluție salina de formol, tamponata cu o concentrație cuprinsă între 8 și 10% (vol./vol.). Proporția dintre fixator și tesut trebuie să fie de cel puțin 20:1 pentru asigurarea unei conservari satisfăcătoare a tesutului.

II.2.2. Tesuturile pentru examinarea virusologica vor fi prelevate de la toți pestii din esantion. Probele vor fi recoltate în dublu exemplar pentru reconfirmarea rezultatelor. Bucăți de ficat, rinichi anterior, inima și splina vor fi prelevate de la pești, folosindu-se un instrument steril, și vor fi transferate într-un tub de plastic conținând 9 ml soluție de transport, adică un mediu de cultura celulara cu antibiotic. Este potrivita o combinație de 12,5 f2æg ml^-1 fungizona, 200 U.I. ml^-1 polimixina B și 200 f2æg ml^-1 kanamicina, dar se pot folosi și alte combinatii a căror eficienta a fost demonstrata. Tesuturile prelevate de la cel mult 5 pești pot fi colectate într-un singur tub conținând soluție de transport și reprezentate pe un singur esantion. Greutatea unei probe de tesut va fi de 1,0 ± 0,5 g.

II.2.3. Amprentele renale vor fi prelevate pentru testul indirect cu anticorpi fluorescenti doar de la pești care au fost ucisi de curând, adică la cel mult două ore de la moarte. O bucata de rinichi median va fi prelevata de la peste, folosindu-se instrumente sterile. Tesutul va fi tamponat cu hârtie absorbanta pentru a îndepărta sangele în exces, apoi se va presa în mod repetat pe o lamela acoperită cu poli-L-lizina. Amprentele individuale vor fi alăturate, dar nu se vor suprapune, pentru a da o continuitate câmpului celular. Sangele și lichidul tisular nu reprezintă un material relevant pentru acest test. Trebuie să se evite "scurgerea" amprentei renale pe hârtia absorbanta pentru ca acest lucru poate produce coagularea sângelui, fapt ce ar produce o mare cantitate de ser proteic pe lamela pentru testare. Amprentele vor fi uscate prin expunere la aer, apoi vor fi păstrate reci și uscate, dacă nu sunt fixate imediat. Fixarea trebuie să se facă în termen de 72 de ore din momentul amprentarii. Alternativ, amprentele pot fi congelate și depozitate pentru maximum o luna la temperatura de -20°C înainte de fixare.

II.2.4. Pestii care prezintă semne de anemie pot fi asomati și imediat li se vor recolta probe de sânge heparinat pentru examenul hematologic, precum și pentru măsurarea hematocritului.

II.2.5. Tesuturile pentru analizele PCR-RT vor fi prelevate de la toți pestii din esantion. Se va preleva de la peste o bucata din rinichiul anterior sau median și, folosindu-se un instrument steril, se va transfera într-un microtub care conține 1 ml soluție pentru conservarea ARN a carei eficacitate e dovedită. Tesuturile care provin de la cel mult 5 pești pot fi colectate într-un singur tub cu soluție conservanta, reprezentând o singura proba. Greutatea unei singure probe de tesut nu va avea mai mult de 0,5 g. Când peștele este prea mic pentru a se putea obține o proba din greutatea cerută, bucățile de rinichi, inima, splina, ficat sau cecumuri pilorice pot fi prelevate, în aceasta ordine, pentru a obține o proba de 0,5 g.

II.3. Expedierea probelor prelevate de la peste

II.3.1. Probele de sânge și tuburile care conțin tesuturi de la peste pentru examinarea virusologica sau pentru analizele PCR-RT vor fi plasate în containere izolate (de exemplu, cutii cu perete gros de polistiren), cu o cantitate suficienta de gheața sau de baterii de refrigerare pentru a asigura racirea probelor pe timpul transportului către laborator. Se va evita congelarea, iar la momentul recepției trebuie să mai existe încă gheața în cutia de transport a recipientului sau una ori mai multe baterii de refrigerare trebuie să fie încă, parțial sau complet, inghetate. În circumstanțe excepționale, probele destinate analizelor PCR-RT și cele destinate examinării virusologice pot fi congelate și transportate la laborator la temperatura de -20°C sau mai scăzută.

II.3.2. Lamelele pentru testul indirect cu anticorpi fluorescenti trebuie să fie expediate în suporturi pentru lamele împreună cu o cantitate suficienta de substanța desicatoare pentru a păstra amprentele uscate și reci după cum se indica mai sus.

II.3.3. Dacă tesuturile peștelui sunt transportate într-o substanța fixatoare pentru examenul histologic, acestea trebuie să fie expediate într-un tub etans plasat într-un recipient rezistent la socuri, ca de exemplu în cutii de polistiren cu pereții grosi.

II.3.4. În afară cazului când probele au fost congelate, examinarea virusologica trebuie să înceapă cat mai curând posibil și nu mai târziu de 72 de ore de la colectarea probelor. Probele pentru analizele de confirmare vor fi stocate la temperatura de -20°C sau mai puțin la sosirea la laborator.

II.3.5. Pestii întregi pot fi transportați la laborator dacă în timpul transportului sunt îndeplinite toate cerințele de temperatura descrise la pct. II.3.1. Peștele întreg va fi invelit în hârtie absorbanta și expediat în punga de plastic la temperatura scăzută, după cum s-a menționat mai sus.

II.3.6. Peștele viu poate fi, de asemenea, expediat, dar numai sub supravegherea unui serviciu oficial.

II.3.7. Pentru analizele PCR-RT ale tesutului conservat în ARNlater, extractul de ARN trebuie transportat într-un anumit timp în funcție de temperatura la care este stocat. Aceste perioade sunt prezentate mai jos:

-37°C o zi;

-25°C o săptămâna;

-4°C o luna;

sub -20°C nedefinit.

II.3.8. Toate ambalarile și etichetarile trebuie să fie executate în conformitate cu prezentele reglementări naționale și internaționale de transport, după cum este adecvat.

II.4. Colectarea unui material de diagnostic suplimentar

Cu acordul laboratorului de diagnostic pot fi recoltate alte tesuturi de la peste și pregătite pentru examinare suplimentară.

III. Examinarea virusologica

III.1. Pregătirea probelor

III.1.1. Atunci când apar dificultăți practice care fac imposibila inocularea celulelor în 72 de ore de la colectarea probelor de tesuturi, este acceptată o congelare a tesuturilor la temperatura de -80°C cel mult 28 de zile. Tesutul trebuie congelat și decongelat doar o singură dată înaintea examinării.

III.1.2. Fiecare proba (tesuturi inundate în soluție de transport) trebuie complet omogenizata, folosindu-se un mixer, blender sau un mojar cu pistil, centrifugata la o turatie de la 2.000 la 4.000 x g timp de 15 minute la o temperatura cuprinsă între 0°C și 6°C, iar supernatantul va fi filtrat (0,45 f2æm) și incubat împreună cu un volum egal de amestec diluant corespunzător de antiser contra serotipurilor indigene ale virusului necrozei pancreatice infectioase, denumita în continuare NPI. Titrul antiserului trebuie să fie de cel puțin 1:2.000 într-un test de neutralizare pe lama de 50%. Amestecul va fi incubat timp de o ora la temperatura de 15°C. Acesta reprezintă inoculumul.

Tratarea tuturor inocula cu ser antivirus contra NPI (un virus care într-o mare parte din Europa este prezent în 50% din probele de la peste) are ca scop prevenirea apariției, pe culturi celulare inoculate, a efectului citopatic, denumit în continuare ECP, prin dezvoltarea virusului NPI în culturile celulare inoculate. Acest lucru va reduce durata examinarilor virusologice, precum și numărul de cazuri în care apariția ECP va trebui considerată ca indicatoare potențiala de virus AIS.

Atunci când probele provin de la unitățile de producție care sunt considerate libere de NPI, tratamentul aplicat la inocula serului antivirusului de NPI nu este necesar.

III.2. Inocularea culturilor celulare

III.2.1. Celulele de SHK-1 (80 pasaje sau mai puțin) ori celulele de TO vor fi cultivate într-un mediu de L-15, care conține 5% ser de fetus bovin, 2% (v/v) 200 mM de L-glutamina și 0,08% (v/v) de 2-mercaptoetanol la 50 mM, pe lame de cultura cu 12 sau 24 de godeuri. Celelalte tulpini celulare ale căror eficacitate și sensibilitate sunt dovedite pentru izolarea virusului AIS pot fi folosite, luându-se în considerare variatiile și abilitatea acestor linii de a se reproduce în diferite tulpini celulare. Suspensia de organe tratata cu antiser trebuie inoculata într-o cultura celulara tanara aflată în faza de creștere activa, pentru a da o dilutie finala de material tisular într-un mediu de cultura la 1:1.000. Pentru fiecare suspensie de organe se vor adauga 40 f2æI inoculat într-un godeu ce conține 2 ml de mediu de cultura. Pentru a reduce riscul contaminarii incrucisate este recomandat să se folosească lame separate de 12 sau 24 de godeuri pentru probele provenite de la diferite locatii de ferme piscicole.

III.2.2. O lama trebuie lăsată neinoculata pentru a servi drept martor negativ. O alta lama va fi inoculata cu un izolat de referința al virusului AIS ca martor pozitiv, după cum urmează: se vor inocula 100 f2æI de preparat al virusului AIS (titrat minim 10^7 TCID 50 ml^-1) în primul godeu și se amesteca bine. Un volum din acest material va fi transferat din primul godeu pe cel de-al doilea pentru a se obține o dilutie de 1:10 bine amestecata. Aceasta operație se va repeta pe toate plăcile pentru a se obține 6 dilutii 1:10. Stocul (preparatia mama) de virus AIS poate fi păstrat la temperatura de -80°C pentru cel mult 2 ani, dar în momentul decongelarii trebuie folosit în cel mult 3 zile. Notă: se va avea grija să se prevină contaminarea incrucisata a probelor cu materialul martorului pozitiv. Pentru evitarea acestui risc, martorii pozitivi se vor aseza separat și se vor manipula separat de lamele de testat.

III.2.3. Probele trebuie incubate la temperatura de 14 ± 2°C pentru cel mult 15 zile.

III.3. Examenul microscopic

Folosindu-se un microscop, se vor examina de doua ori culturi celulare pentru decelarea ECP, prima data între a 5-a și a 7-a zi și apoi între a 12-a și a 14-a zi după inoculare. Dacă un amestec prezintă ECP, se va iniția imediat procedura de identificare a virusului, după cum se arata la pct. III.6. Dacă nu se observa nici o urma de ECP în a 14-a zi, se va executa un test de hemabsorbtie menționat la pct. III.4.

III.4. Hemabsorbtia

Reproducerea virusului AIS în culturi celulare nu are întotdeauna ca rezultat apariția ECP. De aceea, fiecare godeu va face obiectul testului hemabsorbtiei descris mai jos sau, alternativ, fiecare godeu va face subiectul unui test I.F descris, menționat la pct. III.6.1.

III.4.1. Mediul de cultura celulara va fi prelevat din fiecare godeu, inclusiv martorii pozitivi și negativi, și fiecare prelevare va fi pusă într-un tub steril etichetat. Se vor adauga în fiecare godeu 500 f2æl 0,2% (v/v) suspensie de globule roșii spalate din sânge de iepure sau cal ori o suspensie de 0,05% (v/v) de globule roșii spalate din sânge de pastrav-curcubeu sau de somon de Atlantic și se lasă la incubat la temperatura camerei timp de 45 de minute. Celulele roșii vor fi indepartate și fiecare godeu va fi spălat de câte doua ori cu mediul L-15. Fiecare godeu va fi examinat la microscop.

III.4.2. Prezenta ciorchinelui de globule roșii aderand la suprafața celulelor de SHK-1 sau TO va indica prezenta probabila a infectiei cu ortomyxovirus. Dacă testul hemabsorbtiei este pozitiv, se va executa imediat un test de identificare cu virus, după cum este menționat la pct. III.6.

III.5. Subcultivare sau reinsamantare

III.5.1. Subcultivarea se va efectua între a 13-a și a 15-a zi. Se vor adauga 225 f2æl supernatant de cultura în godeurile care conțin celule proaspete de SHK-1 în faza activa de creștere, pe lame de 12 godeuri, apoi se lasă la incubat, la temperatura de 14 ± 2°C cel mult 18 zile. Folosindu-se un microscop, culturile celulare se vor examina de doua ori pentru ECP, între cea de-a 5-a și cea de-a 7-a zi și între cea de-a 14-a și cea de-a 18-a zi după inoculare. Dacă vreun amestec prezintă ECP, imediat va fi initiata procedura de identificare a virusului menționată la pct. III.6. Dacă nu se observa prezenta ECP între cea de-a 14-a și cea de-a 18-a zi, se va executa un test de hemabsorbtie, după cum se prevede la pct. III.4.

III.5.2. Dacă se produce un efect citotoxic în primele 7 zile de incubare, subcultivarea se va executa în acest stadiu și celulele trebuie incubate 14-18 zile și subcultivate din nou cu încă o incubare de 14-18 zile. Dacă efectul citotoxic apare după 7 zile, subcultivarea se va mai executa o singură dată și celulele vor fi incubate pentru a se obține un total de 28-36 de zile de incubare de la prima inoculare.

III.5.3. Dacă apare contaminarea bacteriana în cultura primara, testul trebuie reluat folosindu-se omogenatul de tesut stocat la temperatura de -80°C. Înaintea inocularii omogenatul de tesut este centrifugat la 4.000 x g timp de 30 de minute la o temperatura cuprinsă între 0 și 6°C și supernatantul este filtrat la 0,22 f2æm. Dacă contaminarea bacteriana apare în timpul subcultivarii, supernatantul va fi filtrat la 0,22 f2æm, inoculat pe celule proaspete și incubat încă 14-18 zile.

III.6. Testele de identificare a virusului

Dacă se observa ECP în orice stadiu sau dacă testul hemabsorbtiei este pozitiv, se va efectua identificarea virusului. Metodele de identificare a virusului AIS disponibile sunt: testul imunofluorescentei IF, menționat la pct. III.6.1, și testul PCR-RT, menționat la pct. IV. Dacă se considera ca pot fi prezente alte virusuri se recomanda efectuarea unor teste suplimentare pentru identificarea acestora. Dacă aceste teste nu permit identificarea cu precizie a virusului în mai puțin de o săptămâna, supernatantul trebuie expediat către un laborator național de referința sau către un laborator de referința al Uniunii Europene specializat în bolile peștelui pentru a se identifica imediat virusul.

III.6.1. Imunofluorescenta (IF)

III.6.1.1. Celulele SHK-1 (80 pasaje sau mai puțin) sau celulele de TO vor fi cultivate într-un mediu L-15 care conține: 5% ser de fetus bovin, 2% (v/v) de L-glutamina la 200 mM și 0,08% (v/v) de 2-mercaptoetanol la 50 mM în 24 sau 96 godeuri, cu o densitate care să producă o confluenta mai mare de 50%. Pot fi, de asemenea, folosite alte linii celulare sau medii de creștere cu eficacitate dovedită. Se vor adauga 225 f2æl de supernatant de cultura ce se presupune a fi infectata cu virus în fiecare din cele doua godeuri, se amesteca și se transfera 225 f2æl pe următoarele doua godeuri la o dilutie de 1:5. Doua godeuri suplimentare vor fi lăsate neinoculate pentru a servi drept martor. Probele de la fiecare ferma piscicolă vor fi lucrate pe lame separate, la fel și cele care servesc drept martori. Virusul se controlează folosindu-se un izolat de referința al virusului AIS.

III.6.1.2. Lamelele vor fi incubate la 14±2°C și examinate microscopic în timp de cel mult 7 zile. Dacă se observa ECP într-un stadiu incipient sau dacă acest lucru nu apare în timpul celor 7 zile, următoarea etapa va fi fixarea. Pentru aceasta, godeurile vor fi spalate cu PBS și fixate prin incubare cu acetona 80% timp de 20 de minute la temperatura camerei. Lamelele vor fi uscate la aer și colorate imediat sau stocate la o temperatura cuprinsă între 0 și 6°C pentru maximum 24 de ore înainte de colorare.

III.6.1.3. Duplicatele godeurilor vor fi colorate cu anticorpi monoclonali 3H6F8 de virusul AIS sau orice alt anticorp monoclonal ale cărui eficacitate și specificitate au fost dovedite, diluate în PBS și incubate la temperatura de 37 ± 4°C timp de 30 de minute. Anticorpii monoclonali vor fi îndepărtați și lamelele vor fi spalate de trei ori cu Tween 20 0,05% în PBS. Conjugatul IgG marcat cu FITC (izotiocianat de fluoresceina) antisoarece diluat în PBS trebuie adăugat în fiecare godeu și incubat la temperatura de 37 ± 4°C timp de 30 de minute. Notă: dilutiile de la loturi diferite de anticorpi monoclonali și conjugatul FITC trebuie optimizate în fiecare laborator.

III.6.1.4. Godeurile trebuie examinate imediat, folosindu-se un microscop inversat, echipat pentru examinarea fluorescentei cu un filtru corespunzător pentru stimularea FITC. Un test este considerat pozitiv dacă se observa celule flourescente. Pentru ca un test să fie valid trebuie ca martorii pozitivi sa dea un rezultat pozitiv, iar cei negativi rezultat negativ.

IV. Examinarea probelor prin PCR-RT

IV.1. Aceasta secțiune descrie procedura cerută pentru amplificarea PCR a unei părți a segmentului 8 al genomului virusului AIS care poate fi efectuată pe tesut de peste sau în cultura de virus AIS.

IV.1.1. Extractia ARN

a) Se indeparteaza ARNlater de pe fiecare proba. Se adauga 1 ml de apa distilata tratata cu DEPC în fiecare tub, iar apoi toate tuburile vor fi centrifugate la 13.000 rpm timp de 5 minute la o temperatura cuprinsă între 0 și 6°C.

b) Se va îndepărta supernatantul de pe fiecare proba, apoi se vor adauga 800 f2æl TRIzol (Invitrogen) sau un alt reactiv, care s-a dovedit a fi echivalent sau mai eficient, pe fiecare proba și într-un tub conținând material de control corespunzător (400 f2æl de apa distilata sau omogenat de rinichi prelevat de la pestii indemni de organisme patogene). Dacă este necesar, tesuturile vor fi disociate prin pipetari repetate. Tuburile vor fi incubate la temperatura camerei timp de 5 minute. Se vor adauga în fiecare tub câte 160 f2æl de cloroform, acestea vor fi foarte bine agitate timp de 3 minute, apoi vor fi centrifugate la 13 13.000 rpm timp de 15 minute, la o temperatura cuprinsă între 0 și 6°C.

c) Stratul apos superior va fi transferat într-un microtub de 1,5 ml etichetat, conținând 500 f2æl izopropanol, și tuburile vor fi incubate timp de 10 minute la temperatura camerei, apoi centrifugate la 6.500 rpm timp de 15 minute la o temperatura cuprinsă între 0 și 6°C.

d) Supernatantul va fi îndepărtat și se va adauga 1 ml etanol 75% pe tableta de ARN. Tuburile vor fi apoi centrifugate la 6.500 rpm timp de 15 minute, la o temperatura cuprinsă între 0 și 6°C.

e) Supernatantul se indeparteaza, iar tuburile vor fi lăsate deschise aproximativ 3 minute pentru a permite etanolului rezidual să se evapore. Se vor adauga 15 f2æl de apa distilata tratata cu DEPC pentru a suspenda din nou granula și, dacă este necesar, se supune unei scurte centrifugari.

f) Se va folosi un spectrofotometru pentru a se calcula concentrația de ARN, precum și gradul de puritate al probelor. Densitatile optice se măsoară la 260 și 290 nm.

g) ARN-ul care trebuie folosit imediat (în aceeași zi) poate fi totuși stocat temporar la o temperatura cuprinsă între 0 și 6°C. ARN care nu este utilizat imediat va fi stocat la temperatura de -80°C.

IV.1.2. Transcriptia inversa (RT)

a) Vor fi diluate 2 f2æg de ARN în apa distilata tratata cu DEPC într-un tub de 1,5 ml. Când concentrația de ARN a unei probe este prea mare pentru a permite utilizarea a 2 f2æg în reactia RT, se va utiliza cantitatea maxima posibila de ARN. ARN diluat va fi incubat la o temperatura cuprinsă între 55 și 60°C timp de 10 minute.

b) Tuburile care conțin ARN vor fi plasate pe gheața și se vor adauga reactivi RT pentru a da concentrația finala de 1 xtampon, 1 mM dNTPs, 100 ng hexamer aleatoriu, 20 U RNase inhibitor și 200 U MMLV-TR în volum total de 20 f2æl.

c) Tuburile vor fi incubate la temperatura de 37°C timp de o ora.

d) ADNc va fi stocat la o temperatura cuprinsă între 0 și 6°C atâta timp cat este necesar și va fi utilizat în PCR cat de curând este posibil.

IV.1.3. PCR

a) Se vor adauga 5 f2æl de ADNc la 45 æl amestec PCR pentru a da concentrația finala de 1 xtampon 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM pentru fiecare dNTP, 25 pmol pentru fiecare primer și 1 U de Taq polimeraza. Primerii sunt: ISA+(5'-GGC-TAT-CTA-CCA-TGA-ACG-AAT-C-3') (primerul sens) și ISA-(5'-GCC-AAG-TGT-AAG-TAG-CAC-TCC-3') (primerul contrasens). Controalele negative pentru extragerea RT și PCR trebuie să fie realizate.

b) Tuburile vor fi plasate într-un termociclu programat la temperatura de 94°C timp de 5 minute, urmând apoi 35 de cicluri la 94°C timp de un minut, la 55°C timp de un minut, la 72°C timp de un minut, cu o incubație finala la 72°C timp de 5 minute.

c) Rezultatul PCR va fi evaluat în urma electroforezei, folosindu-se un gel de agar 2% colorat cu bromura de etidium și incluzând semne paralele marcate de-a lungul probelor și controlul negativ pentru etapele RT și PCR. Un singur produs de PCR de 155 pb va fi considerat un indicativ pentru prezenta ARN al virusului AIS. Probele care conțin un produs suplimentar de 310 pb vor fi, de asemenea, considerate a conține ARN al V virusului AIS. Probele care produc produse multiple PCR, incluzând cel puțin unul de aproximativ 155 pb, pot conține ARN al virusului AIS. Acestea pot fi investigate în continuare, folosindu-se probele de ADN sau secventa nucleotidelor.

IV.1.4. Confirmarea prin PCR a virusului AIS izolat în cultura tisulara

Dacă un efect citopatic (ECP) complet a fost observat în cursul examinării virusologice a probelor de tesut în celulele SHK-1, se vor îndepărta 400 f2æl de supernatant de pe godeu și vor fi puse într-un tub steril de 1,5 ml. Se va extrage ARN din această probă, după cum s-a arătat la pct. III.1, și se va efectua testul PCR-RT. Dacă sunt folosite culturi fără CPE complet, supernatantul va fi îndepărtat, celulele vor fi razuite de pe suprafața godeului sau flaconului și plasate într-un tub steril de 1,5 ml pentru a se extrage ARN și a se efectua un test PCR-RT.

IV.1.5. Confirmarea produselor de PCR cu ajutorul probelor ADN

a) Specificitatea unui produs PCR de 155 pb poate fi evaluată prin probarea unei oligonucleotide care hibrideaza într-o regiune a produsului PCR, excluzandu-se. Produsele PCR vor face obiectul electroforezei în gel de agar 1%, în paralel cu marcarea mărimii și cu un control pozitiv și unul negativ pentru etapele RT și PCR.

b) ADN va fi supus reacției Southern-blot pe o membrana și oligonucleotidele marcate (5'-CGGGAGTTGATCAGACATGCACTGA AGGTG-3') vor fi incubate cu membrana, după etapele corespunzătoare prehibridarii.

c) Probele nefixate și cele fixate nespecific vor fi spalate de pe membrana, iar probele fixate vor fi vizualizate.

d) Probele fixate pe un fragment de 155 pb (și 310 bp dacă este prezent) vor fi evidentiate pentru specificitatea PCR și indica faptul ca ARN virusul AIS a fost prezent în proba.

IV.1.6. Secventierea nucleotidica a produselor PCR

Specificitatea produselor de PCR poate fi evaluată prin examinarea secventei nucleotidelor din produsul PCR de 155 pb.

a) Produsul PCR va fi curatat de gel de agar sau de soluție.

b) Fragmentul va fi secventiat, folosind aceiași primeri ca cei utilizați pentru reactia PCR sau primeri vectori, dacă fragmentul a fost clonat într-un vector înaintea secventierii.

c) Secventa nucleotidelor va fi comparata cu cea a segmentului 8 al virusului AIS, disponibilă în baza de date EMBL pentru secvente nucleotidice (la numerele de acces Y10404, AJ012285, AJ242016).

d) Prezenta secventei corespunzătoare celei a segmentului 8 al virusului AIS este o dovadă a faptului ca proba conține ARN al virusului AIS.

V. Examinarea amprentelor renale prin testul IAF

V.1. Următorul protocol a fost stabilit pentru examinarea amprentelor renale prin testul IAF

V.2. Prepararea și colorarea amprentelor

V.2.1. Lamelele vor fi fixate în acetona sau în metanol/acetona (1:1) timp de 3 minute și apoi uscate în aer. Înainte de colorare fiecare lamela va fi examinata, iar zonele corespunzătoare ale fiecărei lamele vor fi incercuite cu ajutorul unui creion lmmEdge TM sau cu unul similar acestuia și lăsate să se usuce în aer. Lamelele vor fi apoi plasate într-o soluție de blocare (lapte smantanit 6% în PBS conținând Tween 20 0,2%) și incubate împreună cu o agitare ușoară timp de 30 de minute la temperatura camerei. Fiecare lamela va fi uscata și plasata orizontal într-o cutie glisiera care conține hârtie umeda pentru a menține o atmosfera umeda.

V.2.2. Fiecare amprenta va fi acoperită cu o soluție de anticorp monoclonal 3H6F8 contra virusului AIS (sau orice alt anticorp cu eficacitate și specificitate dovedite) și cutia glisiera va fi închisă și incubata cu agitare timp de 60 de minute la temperatura camerei. În mod normal, anticorpul va fi diluat 1:10 și 1:100 în lapte smantanit 1%, însă dilutia reală trebuie determinata pentru fiecare lot. Lamelele vor fi spalate de câte 3 ori timp de doua minute în PBS conținând 0,1% Tween 20. Fiecare amprenta va fi acoperită cu o soluție conținând conjugat de capra antisoarece colorat FITC, diluat 1:1.000 în lapte smantanit 1%, și incubata într-o atmosfera umeda timp de 60 de minute la temperatura camerei. Lamelele vor fi spalate de câte 3 ori timp de doua minute în PBS conținând 0,1% Tween 20. Fiecare lamela va fi acoperită cu o soluție de Citifluortm [500 f2æl Citifluortm amestecat cu 1,5 ml de Tween 20 0,1% (v/v) în PBS] sau cu orice alt mediu de fixare potrivit, timp de 10 minute. Lamelele vor fi spalate de 3 ori în PBS conținând 0,1% Tween 20. Dacă este necesară o contracoloratie, fiecare amprenta poate fi acoperită cu iodura de propidium (0,01 mg/ml) în PBS conținând 0,1% Tween 20 și incubata timp de 3 minute la temperatura camerei. Lamelele vor fi spalate de 3 ori câte doua minute în PBS conținând 0,1% Tween 20. Lamelele vor fi uscate și fixate în Citifluortm sau în orice alt mediu de fixare potrivit. Lamelele vor fi stocate în intuneric la temperatura de 4°C înainte de examinarea la microscop.

V.3. Examinarea la microscop folosind fluorescenta

Fiecare lamela va fi examinata la un microscop adecvat pentru epifluorescenta, folosindu-se un filtru potrivit care va excita FITC producand un verde caracteristic, fluorescent. Toate campurile din zonele definite de creionul ImmEdge TM vor fi examinate sub obiective x 10 și x 20 și zonele suspecte (cele care prezintă un verde fluorescent) vor fi în continuare examinate sub un obiectiv x 40 și cu iluminare fluorescenta/faza pentru a se asigura ca fluorescenta este bine localizata în celule. Coordonatele zonelor suspecte vor fi înregistrate pentru o confirmare ulterioară a naturii fluorescentei de către un al doilea examinator. După citirea primului examinator, lamelele care sunt pozitive sau cele suspecte vor fi reexaminate de un al doilea examinator și rezultatele confirmate.

V.4. Controlul

V.4.1. Trebuie efectuate 3 tipuri de controale pentru fiecare lot de lamele colorate pentru TIAF:

- amprentele renale de la somonul de Atlantic neinfectat (control negativ);

- culturile celulare SHK-1 neinfectate sau orice alte culturi celulare sensibile (control negativ);

- culturile celulare SHK-1 afectate de virusul AIS sau orice alte culturi celulare sensibile (control pozitiv).

V.4.2. Dacă este posibil, se recomanda ca o amprenta renala de la un somon de Atlantic infectat cu virusul AIS să fie supusă unui control pozitiv suplimentar.

V.4.3. Dacă un rezultat pozitiv este obținut în orice control negativ, testul este considerat invalid pentru toate lamelele care compun acel lot. Dacă toate lamelele din lot, supuse unui control pozitiv, sunt negative, testul este considerat invalid pentru toate lamelele care compun lotul respectiv. În cazul nereusitei controlului unui lot de lamele, acesta va fi distrus și se va efectua o retestare folosindu-se duplicatele de amprente.

V.5. Examinarea altor tesuturi

Aceasta tehnica poate fi aplicată altor tesuturi de peste, cum ar fi ficatul, splina și inima, cu condiția ca o cantitate corespunzătoare de celule endoteliale, leucocite sau limfocite să poată fi depozitata pe lamela. Procedura standard rămâne aceeași pentru fiecare tesut, deși pentru unele tesuturi este de preferat omiterea coloratiei cu iodura de propidium recurgand la iluminarea în faze pentru identificarea tipului de celule prezente pe amprenta.

VI. Histologia

Secțiunile incluse în parafina vor fi tăiate la 5 f2æm și colorate, folosindu-se hematoxilina și eosina. Schimbările histologice asociate cu AIS sunt descrise în editia curenta a "Manualului OIE de diagnostic al bolilor animalelor acvatice".

VII. Acronime și abrevieri

ADNc Acid deoxiribinucleic complementar

ECP Efect citopatic

DEPC Dietilpropocarbonat

dNTP Deoxinucleotida trifosfat

IF Imunofluorescenta

TIAF Testul indirect cu anticorpi fluorescenti

OIE Oficiul Internațional de Epizootii

VNPI Virusul necrozei pancreatice infectioase

PBS Tampon fosfat salin

ARN Acid ribonucleic

PCR-RT Reactia lantului polimeric (transcriptia reversibila)

SHK-1 Celulele de rinichi anterior de somon

TCID50 Doza infectanta pentru 50% din culturile celulare

--------------